簡(jiǎn)化復雜的熒光多孔板檢測方法

細胞凋亡或程序性細胞死亡發(fā)生在生物體胚胎發(fā)育過(guò)程中以消除不需要的細胞，或者發(fā)生在成年人的愈合過(guò)程中，以消除身體的受損細胞，幫助預防癌癥。用多孔板進(jìn)行的Caspase檢測實(shí)驗使研究人員能夠研究細胞凋亡的早期階段。在這篇文章中，我們展示了MICA如何與熒光多孔板測定一起應用，以提供*時(shí)空相關(guān)性的數據，并將串擾降至zui di。

U2OS細胞在加入細胞凋亡誘導劑星形孢菌素后，在13小時(shí)延時(shí)成像過(guò)程中拍攝標記了SiR Actin、TMRE、CellEvent™和DAPI的圖像。

熒光檢測的基礎知識

多孔板對于需要更高通量的實(shí)驗非常有用。它們能讓用戶(hù)收集384、96或24個(gè)不同的平行實(shí)驗（或樣品）的數據 ^[1]?，F代檢測試劑盒通常用熒光探針或染料來(lái)標記感興趣的蛋白，然后再用熒光顯微鏡對每個(gè)孔板中熒光標記的樣品進(jìn)行分析^[2,3]。高通量的熒光多孔板檢測在神經(jīng)科學(xué)、癌癥研究和發(fā)育生物學(xué)等領(lǐng)域的很多實(shí)驗中都有廣泛的應用。幸運的是，許多這類(lèi)熒光檢測的試劑盒在市場(chǎng)上可以買(mǎi)到，這有助于大大簡(jiǎn)化樣品制備，為用戶(hù)節省大量的時(shí)間和精力。
 

細胞凋亡和Caspase蛋白

細胞凋亡或程序性細胞死亡發(fā)生在生物體胚胎發(fā)育過(guò)程中以消除不需要的細胞，或在成年人的愈合過(guò)程中消除身體的受損細胞，幫助預防癌癥^[4-6]。Caspases家族（含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶）是一個(gè)大型的半胱氨酸蛋白酶家族，在細胞凋亡的啟動(dòng)和執行中起著(zhù)重要作用^[5,6]。啟動(dòng)型caspases幫助啟動(dòng)細胞凋亡，而執行型caspases進(jìn)行大量蛋白水解。Caspase-3和caspase-7都是執行者型caspases^[5,6,7]。caspase-3在細胞凋亡過(guò)程中有協(xié)調細胞結構破壞的作用，而caspase-7有細胞脫離的作用^[7]。
 

Caspase測定法

Caspase檢測可以研究細胞凋亡的早期階段。在這里，我們研究了caspase-3和capase-7被細胞毒性藥物（如星形孢菌素）激活的劑量依賴(lài)性。為了消除隨機效應，在相同的條件下用不同濃度的一種藥物或多種藥物的組合，對多個(gè)檢測樣本進(jìn)行了研究。具有統計學(xué)意義的結果通常需要重復實(shí)驗數次。
 

Caspase檢測中的挑戰

caspase檢測透露的主要是caspase激活級聯(lián)開(kāi)始時(shí)的信息。然而，關(guān)于單個(gè)細胞的其他形態(tài)學(xué)或激活反應的問(wèn)題仍未得到解答。Caspase檢測中加入更多的熒光染色劑可以獲得更多的信息，例如在凋亡過(guò)程中的細胞骨架行為或xi bao se su c介導的凋亡小體的組裝導致caspase-3和caspase-7切割途徑的激活^[8]。在caspase檢測中要快速收集所有熒光標簽的信號，從而實(shí)現在規定時(shí)間間隔獲取整個(gè)樣本板上的數據，可能是很困難的。其次，很難快速并可靠地分離多達四個(gè)熒光標簽的信號。最后，如果數據的獲取與caspase活性的檢測不是同步的，它們就不直接相關(guān)。  

由于這些挑戰，在進(jìn)行caspase測定，特別是在結合額外的標記以獲得更多信息時(shí)，常常會(huì )有一些擔憂(yōu)。激活反應前后和形態(tài)學(xué)數據可能會(huì )丟失或沒(méi)有時(shí)空即位置和時(shí)間方面的相關(guān)性。另外，熒光標簽之間的串擾也會(huì )導致對結果的誤解。

目前，大量的研究實(shí)驗室可能沒(méi)有現成的用于這些檢測工作的所有儀器和顯微鏡。這個(gè)問(wèn)題通常通過(guò)使用多個(gè)研究小組和用戶(hù)的共享設備來(lái)解決，但這意味著(zhù)可能需要很長(cháng)時(shí)間才能獲得所需的儀器。

這些挑戰可能導致延遲獲得重要的、可量化的結果，而這些結果會(huì )影響根本性突破和獲得新的見(jiàn)解。
 

Mica介紹

Mica是全場(chǎng)景顯微成像分析平臺，它將研究人員需要的一切都統一在一個(gè)wan quan可控的、高度靈活的環(huán)境中，加速顯微鏡的工作流程，以便更快地獲得有意義的科學(xué)結果。通過(guò)使用這個(gè)顯微成像分析平臺，您可以從以下方面受益：

人人皆享：即使是沒(méi)有經(jīng)驗的用戶(hù)也能用MICA輕松設置復雜的檢測讀數。

觸手可及：MICA使得用戶(hù)能同時(shí)對4個(gè)標記進(jìn)行成像，具有*的時(shí)空相關(guān)性。  

ji zhi簡(jiǎn)化工作流程：MICA對4個(gè)標記的同時(shí)采集以及后續AI驅動(dòng)的數據分析都顯著(zhù)減少了工作流程步驟。

方法

MICA用于熒光多孔板檢測來(lái)研究caspase-3和caspase-7在激活凋亡中的作用（圖1）。制備U2OS細胞相關(guān)樣品，最后用星形孢菌素處理以誘導細胞凋亡。本實(shí)驗有多個(gè)與凋亡早期階段相關(guān)的讀數。

結果

圖1結果顯示了星形孢菌素誘導的caspase-3和caspase-7的激活，在此之前是應力纖維的形成和線(xiàn)粒體膜電位的耗盡。

圖3為傳統寬場(chǎng)顯微鏡和MICA的時(shí)空多色采集對比。熒光標記的同步檢測在研究線(xiàn)粒體動(dòng)力學(xué)時(shí)，消除了觀(guān)察線(xiàn)粒體結構和膜電位時(shí)的時(shí)空偽影。使用傳統寬場(chǎng)成像時(shí)，由序列采集產(chǎn)生的時(shí)空偽影會(huì )使測量結果失真，并影響結構和功能的相關(guān)性。MICA的FluoSync技術(shù)能同時(shí)采集并確保時(shí)空相關(guān)性，采集時(shí)沒(méi)有偽影，膜電位與線(xiàn)粒體結構正確相關(guān)。

與傳統的寬場(chǎng)顯微鏡不同的是Mica FluoSync^[10]可以同時(shí)進(jìn)行4色標簽成像、寬光譜譜檢測和拆分^[9] （參加圖4）。

參考資料

1. C. Gilbrich-Wille, Consumables for Laser Microdissection: The right solution for every application, Science Lab (2015) Leica Microsystems.

2. W. Ockenga, An Introduction to Fluorescence, Science Lab (2011) Leica Microsystems.

3. W. Ockenga, Fluorescence in Microscopy, Science Lab (2011) Leica Microsystems.

4. C.P. Austin, Apoptosis, National Human Genome Research Institute (NHGRI), National Institutes of Health (NIH).

5. R. Jan, G.-e-S. Chaudhry, Understanding Apoptosis and Apoptotic Pathways Targeted Cancer Therapeutics, Adv. Pharm. Bull. (2019) vol. 9, iss. 2, pp. 205-218, DOI: 10.15171/apb.2019.024.

6. S. Elmore, Apoptosis: A Review of Programmed Cell Death, Toxicologic Pathology (2007) vol. 35, iss. 4, pp. 495–516, DOI: 10.1080/01926230701320337.

7. J.G. Walsh, S.P. Cullen, C. Sheridan, A.U. Lüthi, C. Gerner, S.J. Martin, Executioner caspase-3 and caspase-7 are functionally distinct proteases, PNAS (2008) vol. 105, no. 35, pp. 12815-12819; DOI: 10.1073/pnas.0707715105.

8. S. Cullen, S. Martin, Caspase activation pathways: some recent progress, Cell Death Differ. (2009) vol. 16, iss. 7, pp. 935–938, DOI: 10.1038/cdd.2009.59.

9. F. Cutrale, S.E. Fraser, A New Method for Convenient and Efficient Multicolor Imaging: Interview, Science Lab (2022) Leica Microsystems.

10. FluoSync - a Fast & Gentle Method for Unmixing Multicolour Images: A streamlined approach for simultaneous multiplex fluorescent imaging using a single exposure, Science Lab (2022) Leica Microsystems.