顯微課堂 | 清晰對比、無(wú)霧的 3D 樣本實(shí)時(shí)圖像

Computational Clearing是THUNDER成像儀的核心技術(shù)。它檢測并去除每張圖像中的失焦背景，使得感興趣的信號可以直接獲取。同時(shí)，在清晰聚焦的區域，邊緣和樣本特征的強度得以保留。當使用基于相機的熒光顯微鏡記錄圖像時(shí)，“不需要的"背景會(huì )與“需要的"清晰結構信號疊加，并且兩者總是被記錄。為了獲得最佳效果，目標是盡可能減少背景。為了從圖像中排除不需要的背景，找到準確分離背景與所需信號的關(guān)鍵標準至關(guān)重要。一般來(lái)說(shuō)，背景在記錄的圖像中表現出特征行為，這與其來(lái)源無(wú)關(guān)。因此，僅憑其在圖像中的外觀(guān)，無(wú)法辨別背景的來(lái)源。特別是在生物樣本中，背景通常不是恒定的。它在視場(chǎng)（FOV）中是相當可變的。Computational Clearing自動(dòng)考慮這一點(diǎn)，使得清晰信號可以立即獲取。

圖 1：聚焦和失焦 PSF 的示意圖：寬場(chǎng)圖像的 PSF（中）可以有效地通過(guò)聚焦的兩個(gè) PSF 分量（左）和失焦的 PSF 分量（右）來(lái)描述。背景估計利用了這樣一個(gè)事實(shí)，即失焦信號的結構長(cháng)度尺度S[ ? Iout] 大于相應的結構長(cháng)度尺度r0，該尺度由聚焦信號的寬度給出。

使用寬場(chǎng)顯微鏡獲取的圖像可以分解為兩個(gè)組成部分：清晰信號和背景信號。背景信號主要來(lái)自失焦信號。因此，寬場(chǎng)圖像 I(r) 可以近似表示為：

其中 psfof/if(r) 和 f(r) 分別是清晰（if）和失焦（of）貢獻的有效點(diǎn)擴散函數以及熒光分布。由于失焦 PSF 的寬度遠大于清晰 PSF，因此在公式 (1) 中，這兩個(gè)貢獻可以通過(guò)長(cháng)度尺度區分算法（例如小波變換）清晰分開(kāi)。我們開(kāi)發(fā)了一種迭代算法來(lái)分離這兩個(gè)貢獻。它在每次迭代中計算以下最小化：

這里S[ ?Iout]表示估計的失焦貢獻的結構長(cháng)度尺度Iout。結構長(cháng)度尺度r0（公式 (2)）是基于系統的光學(xué)參數計算的，并且可以進(jìn)行調整。在LAS X 軟件中，它被稱(chēng)為“特征"尺度。

使用這種方法，僅去除了背景（BG）。保留了來(lái)自感興趣的失焦樣本區域的信號和噪聲。由于失焦區域的噪聲仍然存在，圖像中失焦特征的邊緣是可見(jiàn)的，因此保持了樣本特征與其特征尺度之間的空間關(guān)系。盡管生命科學(xué)樣本中背景的變化特性，特征的相對強度仍然得以保留。

與傳統的包容性方法不同，使用Computational Clearing揭示的圖像不是生成的，而是從樣本中的背景信號中“解鎖"的。

圖 2：用 Cy5 標記的βIII 微管大鼠神經(jīng)細胞顯示結構的邊緣，這些結構在Computational Clearing后得以保留，以及結果背景。圖像是使用THUNDER Imager 3D 細胞培養顯微成像系統和 HC PL APO 63x/1.40 油鏡頭獲取的。

Computational Clearing去除了背景，清晰地揭示了樣本深處的焦平面。Computational Clearing作為一種的方法，實(shí)際上在與包容性方法結合使用時(shí)變得更加強大。

THUNDER Imager 提供三種模式供選擇：

即時(shí)Computational Clearing（ICC）是獨占Computational Clearing方法的同義詞，正如在本技術(shù)說(shuō)明書(shū)開(kāi)頭介紹的那樣。SVCC 和 LVCC 是獨占Computational Clearing與基于決策掩模的 3D 去卷積的結合，專(zhuān)門(mén)用于薄樣品（SVCC）或厚樣品（LVCC）。包容性方法的自適應圖像信息提取遵循一個(gè)概念，該概念源于 LIGHTNING，徠卡顯微系統的自適應去卷積方法，最初為共聚焦顯微鏡開(kāi)發(fā)。

LIGHTNING 使用決策掩模作為基準參考，以計算圖像每個(gè)體素的適當參數集。結合寬場(chǎng)點(diǎn)擴散函數（PSF），LIGHTNING 固有的自動(dòng)化自適應去卷積過(guò)程的功能可以轉移到寬場(chǎng)檢測中。

在本節中，展示了實(shí)驗數據以證明：

InSpeck 珠子是微球標準，生成一系列明確定義的熒光強度水平，用于構建校準曲線(xiàn)和評估樣品亮度。在這個(gè)簡(jiǎn)短的實(shí)驗中，將相同體積的同尺寸熒光珠子和非熒光珠子混合在一起。熒光珠子具有不同的相對強度，即 100%、35%、14%、3.7%、1% 和 0.3%。

InSpeck 珠子被沉積在載玻片上，并使用 20 倍低 NA 物鏡對 156 個(gè)位置進(jìn)行了成像（圖 3，單個(gè) z 位置）。記錄了三個(gè)通道（圖 3 從左到右）：明場(chǎng)（BF），相位對比（PH）和熒光（FLUO）。FLUO 強度經(jīng)過(guò)調整，以避免明亮物體導致相機傳感器飽和。為了糾正潛在的不均勻照明，使用了視場(chǎng)中心區域。

使用了 FOV。沒(méi)有進(jìn)行進(jìn)一步的平場(chǎng)校正。FLUO 圖像使用即時(shí)Computational Clearing（ICC）進(jìn)行后處理，特征尺度為 2500 nm，與微珠尺寸一致。

珠子是通過(guò)簡(jiǎn)單閾值處理 PH 圖像找到的。為了糾正錯誤檢測到的珠子，僅接受某一大?。?8 到 76 像素）且圓度≥0.99 的圓形物體。該掩膜用于獲取原始熒光和 ICC 處理通道的平均強度。沒(méi)有排除強度異常值。為了獲得相對值，所有接受的珠子的原始和處理強度都除以其最大強度群體的中位強度（通常是 100%相對強度的熒光珠子）。在圖 4（右）中，黑線(xiàn)顯示，經(jīng)過(guò)Computational Clearing后，強度仍然接近預期值。

結論：Computational Clearing技術(shù)使得即使是最弱信號群體的真實(shí)熒光動(dòng)態(tài)也能被區分，這在原始數據中是不可觀(guān)察的。使用Computational Clearing技術(shù)時(shí)，發(fā)射強度的量化非常簡(jiǎn)單。然而，對于此類(lèi)實(shí)驗，需要非常嚴格地遵循定量熒光顯微鏡的良好實(shí)踐。

以下實(shí)驗展示了 ICC 如何處理背景中的巨大差異和異質(zhì)性。準備了一種不同強度的綠色熒光珠群，并將其分散在載玻片上。珠子以混合強度出現，但呈現出簇狀（圖 6，左）。通過(guò)從濾光塊中移除激發(fā)濾光片，并用記號筆在載玻片的一半添加熒光素背景，提供了一般背景。定義了兩個(gè)大小相等的非重疊視場(chǎng)區域：一個(gè)在熒光素區域內，即高背景瓷磚掃描（圖 5：區域 A，左），另一個(gè)在沒(méi)有熒光素的區域，即低背景瓷磚掃描（圖 5：區域 B，右）。

對于每個(gè)視場(chǎng)，通過(guò)簡(jiǎn)單的閾值處理 BF 圖像（圖 6，左）來(lái)識別珠子。從這個(gè)掩膜中獲得原始圖像和 ICC 處理圖像的平均熒光強度。

不符合特定圓度和大小的物體被丟棄，未用于進(jìn)一步分析。沒(méi)有應用其他異常值修正?？偣苍趨^域 A（高且不均勻背景）中識別出 39,337 個(gè)物體，在區域 B（低背景）中識別出 43,031 個(gè)物體。用于后續比較的強度，從區域 A 隨機選擇 39,337 個(gè)物體，以使兩個(gè)區域的樣本大小匹配。

區域 A（高背景）和 B（低背景）中物體的強度分布非常不同（Kolmogorov Smirnov 距離：0.79±0.2，置換重采樣）?？梢钥吹揭话愕钠坪吞砑拥谋尘埃▓D 7，左側藍色）。在Computational Clearing后對數據進(jìn)行的相同分析顯示兩個(gè)區域的分布非常相似（KS：0.05±0.02）。

結論：Computational Clearing可以處理圖像數據中固有的異質(zhì)背景信號，這些信號在真實(shí)生物樣本中是普遍存在的。此外，它允許在不需要繁瑣的局部背景去除算法的情況下量化熒光信號，這些算法通常需要為每個(gè)成像會(huì )話(huà)進(jìn)行調整（即使是對于同一物體）。

為進(jìn)一步展示 ICC 的線(xiàn)性行為，記錄了在固定視場(chǎng)內穩定熒光物體（15 微米珠子）在不同曝光時(shí)間下的圖像。為了排除照明啟動(dòng)效應，物體始終用激發(fā)光照明。由于珠子的低密度和平坦性，原始圖像中的背景主要來(lái)自相機偏移。ICC 參數根據物體大小設置：15 微米，強度最高（100%）。

圖 8：原始圖像（上排）和使用Computational Clearing（下排）在不同曝光時(shí)間（列）下拍攝的圖像，按各自的曝光時(shí)間進(jìn)行劃分。綠色點(diǎn)：用于進(jìn)一步分析的物體。紅色方框：傳統背景減法的區域。比例尺：100 微米。

最后，ICC 與傳統的 BG 減去數據進(jìn)行了比較。這一步通常是量化強度的必要步驟。計算了每幅圖像中無(wú)對象區域（100 x 100 像素，如圖 8 中紅色方框所示）的平均強度，并從同一圖像的強度數據中減去。繪制先前找到的對象的平均強度與傳統 BG 減去的原始數據的關(guān)系。

顯示 ICC 給出了相同的結果（圖 9，右側）。結論：ICC 表現出線(xiàn)性行為。它使數據量化成為可能，而無(wú)需進(jìn)一步的圖像處理，這在背景異質(zhì)性較強時(shí)尤其繁瑣。

可成像的最大深度高度依賴(lài)于樣本。熒光團的密度、吸收或樣本內局部折射率的均勻性等因素直接影響信噪比和每個(gè)體素的散射光量。這些因素通常會(huì )波動(dòng)，即使在同一視野內也是如此。

在基于相機的系統中，實(shí)現 3D 樣本的光學(xué)切片的經(jīng)典方法是使用多點(diǎn)照明，例如使用尼普科盤(pán)或網(wǎng)格投影設備。后者在網(wǎng)格無(wú)法在焦平面上清晰投影時(shí)會(huì )引入偽影。另一方面，基于盤(pán)的系統必須處理針孔之間的有限距離，這在某些成像深度引入了來(lái)自失焦平面的光污染。

通過(guò)Computational Clearing，在足夠透明的樣本中，最大深度主要取決于發(fā)射光的散射。Computational Clearing通過(guò)去除散射光成分來(lái)實(shí)現深層成像。如果在圖像中至少可以局部獲得一些對比度，THUNDER成像儀使其變得可訪(fǎng)問(wèn)。Computational Clearing的一個(gè)大優(yōu)勢是它可以與活體標本一起使用，因此成像可以在生理條件下進(jìn)行。

對比噪聲比越好，重建結果就越好。對于圖 10 中所示的例子，使用了大體積Computational Clearing（LVCC），這是一種Computational Clearing和自適應去卷積的結合，用于成像厚樣本體積。在樣本的上層，甚至最細微的細節都能被解析并進(jìn)行分割。盡管在更深層次的分辨率和分割可能會(huì )降低，但在樣本深度為 140 到 150 微米（圖 11）時(shí)，顯示出大量有價(jià)值的細節，這些細節在原始數據中并未顯現。沒(méi)有THUNDER，大多數寬場(chǎng)成像實(shí)驗在 50 微米的深度就停止，因為人們認為無(wú)法獲取更多信息。

圖 11：深度為 140 到 150 微米的最大強度投影。

將小體積Computational Clearing（SVCC）應用于單個(gè)、非重疊、衍射極限物體會(huì )導致分辨率增強，如下圖 12 所示。在給定的例子中，成像了一個(gè)直徑為 40 納米的單個(gè)珠子（100 倍，1.45 NA 物鏡），并應用了默認設置的 SVCC。結果是橫向分辨率增強* 2 倍（比率 FWHMX SVCC/Raw = 0.51），縱向分辨率增強超過(guò) 2.5 倍（比率 FWHMZ SVCC/Raw = 0.39）。

*分辨率增強被定義為發(fā)光點(diǎn)源的表觀(guān)大小。在折射極限以下，無(wú)法分離彼此靠近的兩個(gè)結構。

圖 12：?jiǎn)蝹€(gè)珠子的 X 軸（左）和 Z 軸（右）強度測量，尺寸低于光學(xué)分辨率極限：SVCC 之前（藍點(diǎn)）和 SVCC 之后（紅點(diǎn)）以及擬合的高斯曲線(xiàn)（陰影）。插圖顯示了相應的 XY 和平面。